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赛恩斯;两篇Science论文在破解核孔复合体结构和功能方面取得新突破
来源:网络        作者:佚名        时间:2022-06-15

无论你在做什么,无论是开车、慢跑,还是最懒的时候,在沙发上吃薯片、看电视,你的每个细胞里都有一套完整的分子机器在努力工作。这些机器太小了,用肉眼甚至用许多显微镜都看不到,它们为细胞创造能量,制造蛋白,复制DNA,等等。

在这些机器中,最复杂的一种是核孔复合体(nuclear pore complex, NPC)。NPC由1000多个蛋白组成,是细胞核中极具辨别能力的守门人,而细胞核是细胞内的膜包围区域,保存着细胞的遗传物质。任何进出细胞核的东西都必须经过NPC。

NPC扮演着细胞核守门人的角色,这意味着它对细胞的运作至关重要。在细胞核内,作为细胞的永久遗传密码,DNA经转录后产生RNA。然后RNA被带出细胞核,以便用于制造细胞所需的蛋白。NPC确保细胞核获得合成RNA所需的材料,同时也保护DNA不受细胞核外恶劣环境的影响,并使RNA在产生后离开细胞核。

加州理工学院化学与生物化学教授André Hoelz说,“这有点像一个可以维修747飞机的机库,门打开让747飞机进来,但是有一个人站在那里,可以在门打开的时候不让玻璃颗弹珠出去。”二十多年来,Hoelz一直在研究和破译NPC的结构与其功能的关系。多年来,他一直在稳步地揭开它的秘密,一点一点地揭开它们。

这类研究的影响可能是巨大的。NPC不仅是细胞运作的核心,而且还涉及许多疾病。NPC突变导致一些无法治愈的癌症、神经退行性疾病和自身免疫性疾病,如肌萎缩性脊髓侧索硬化症(ALS)和急性坏死性脑病,以及包括心房颤动和早期心脏猝死在内的心脏疾病。此外,许多病毒,包括造成COVID-19的冠状病毒SARS-CoV-2,在它们的生命周期中靶向并关闭NPC。

如今,在两项新的研究中,Hoelz和他的研究团队描述了两项重要的突破:确定了NPC的外表面结构,并阐明了特殊蛋白质像分子胶一样将NPC固定在一起的机制。相关研究结果发表在2022年6月10日的Science期刊上,论文标题分别为“Architecture of the cytoplasmic face of the nuclear pore”和“Architecture of the linker-scaffold in the nuclear pore”。

非常微小的三维拼图

在第一项新的研究中,Hoelz团队描述了他们如何绘制出NPC从细胞核向外延伸到细胞质的这一侧的结构。为了做到这一点,他们必须针对每个拼图块使用电子显微镜和X射线结晶学等成像技术,拼出相当于一个非常小的三维拼图。

论文共同第一作者、加州理工学院生物化学与分子生物物理学研究生Stefan Petrovic说,这个过程从经过基因改造后产生构建人类NPC的蛋白的大肠杆菌(实验室中常用的一种细菌菌株)开始。

Petrovic说,“如果你走进实验室,你可以看到烧瓶里面的培养物正在生长。我们在大肠杆菌细胞中表达每种蛋白,裂解这些细胞,并对每种蛋白成分进行化学纯化。”

一旦纯化---这可能需要多达1500升的细菌培养物以获得足够的材料用于单一实验---完成后,Hoelz团队开始艰苦地测试NPC的各个蛋白成分如何结合在一起。

论文共同第一作者、加州理工学院化学博士后高级研究助理George Mobbs说,NPC组装是以“逐步”的方式进行的;这些作者不是同时将所有的蛋白倒入一个试管,而是测试成对的蛋白,看看哪些蛋白会像两个拼图块一样结合在一起。如果找到了一对结合在一起的蛋白,他们就会用这两个现在结合在一起的蛋白与第三个蛋白进行测试,直到他们找到一个与这对蛋白结合在一起的蛋白,然后用产生的三个结合在一起的蛋白与其他蛋白进行测试,以此类推。他们以这种方式研究这些蛋白,最终产生了他们的这篇论文中的最终结果:一个由16个蛋白组成的楔子,像比披萨片一样重复了8次,形成了NPC面向细胞质的外表面。

人类核孔复合体的细胞质侧,图片来自Science, 2022, doi:10.1126/science.abm9129。

论文共同第一作者、加州理工学院化学博士后副研究员Si Nie说,“我们报告了人类NPC整个细胞质面的第一个完整结构,同时进行了严格的验证,而不是报告一系列基于部分、不完整或低分辨率观察的片段或部分的渐进进展。我们决定耐心等待,直到我们获得所有必要的数据,报告了大量的新信息。”

他们的研究补充了德国马克斯-普朗克生物物理研究所的Martin Beck开展的研究,Beck及其研究团队使用低温电子断层扫描技术生成了一个提供这个三维拼图的轮廓的图片,而Hoelz团队必须将这些拼图块放到这个三维拼图中。为了加速完成人类NPC结构的拼图,Hoelz和Beck在两年多前交换了数据,然后独立构建了整个NPC的结构。Hoelz说,“经过大幅改进的Beck图片更清楚地显示了我们确定了原子结构的NPC的每个拼图块的放置位置,这就像确定了一个拼图块边缘的木框。”

Hoelz小组通过实验确定的NPC拼图块(即NPC的蛋白成分)的结构有助于验证Beck团队的建模工作。Petrovic说,“我们使用不同的方法独立地将每个NPC拼图块的结构放入这个三维拼图中,但最后的结果完全一致。看到这一点是非常令人满意的。”

论文共同第一作者、加州理工学院化学高级博士后研究助理Christopher Bley说,“我们建立了一个框架,现在可以在这个框架上做很多实验。我们现在有了这种复合结构,它使未来关于NPC功能甚至疾病的实验成为可能并为之提供信息。NPC中有很多突变与可怕的疾病有关,知道它们在结构中的位置以及它们如何聚集在一起,可以帮助设计下一组实验,试图回答这些突变所起何种作用的问题。”

“优雅的意大利面条排列方式”

在第二项新的研究中,Hoelz团队描述了他们如何确定NPC的连接-支架(linker-scaffold)的整个结构。NPC的蛋白成分分为支架型核孔蛋白(nucleoporin, Nup)和连接型Nup,它们将帮助将NPC固定在一起,同时也为它提供了开启和关闭以及调整自身以适应通过的分子所需的灵活性。

Hoelz将NPC比作由乐高积木搭建而成的东西,这些积木组装在一起,但没有锁在一起,而是被橡皮筋绑在一起,使它们大部分保持在原位,同时仍然允许它们有一点移动。

Hoelz说,“我把这些非结构化的胶块称为‘核孔的暗物质’。这种优雅的意大利面条排列将一切都保持在一起。”

这种表征NPC连接-支架结构的过程与表征NPC其他部分的过程基本相同。Hoelz团队制造并纯化了大量的多种类型的连接型Nup和支架型Nup,使用各种生化实验和成像技术来检查不同种蛋白之间的相互作用,并逐个测试它们,看它们在完整的NPC中是如何组装在一起的。

为了验证他们的研究,他们将突变引入编码活细胞中每个编码连接型Nup的基因中。由于他们知道这些突变将如何改变特定连接型Nup的化学性质和形状,使其具有缺陷,他们可以预测当这些有缺陷的蛋白被引入时,细胞的NPC结构会发生什么。如果细胞的NPC在功能和结构上出现了他们预期的缺陷,他们就知道他们有正确的连接型Nup排列。

Petrovic说,“细胞比我们在试管中创建的简单系统要复杂得多,因此有必要验证从体外实验中获得的结果在体内是否成立。”

NPC外表面的组装也帮助解决了一个关于核膜---环绕细胞核的双膜系统---的长期之谜。与细胞膜一样,核膜也不是完全光滑的。相反,它布满了称为膜内在蛋白(integral membrane protein, IMP)的分子,这些分子发挥着各种作用,包括充当受体和帮助催化生化反应。

尽管IMP在核膜的内侧和外侧都能找到,但人们一直不清楚它们实际上如何从一侧移动到另一侧。事实上,由于IMP镶嵌在核膜的内部,它们不能像自由漂浮的分子那样滑行通过NPC的中央运输通道。

一旦Hoelz团队理解了NPC的连接-支架结构,他们意识到它允许在它的外缘形成小的“沟渠”,使IMP能够从核膜的一侧滑过NPC到核膜的另一侧,同时始终保持本身嵌入核膜中。

Hoelz说说,“我很高兴地看到,正如我们十多年前最初提出的那样,NPC的中央传输通道确实有能力为这些IMP扩张并形成侧门。”

总的来说,这两篇论文的发现代表了科学家们对人类NPC如何构建以及如何发挥作用的理解有了飞跃。Hoelz团队的发现为更多的研究打开了大门。Hoelz说,“在确定了它的结构之后,我们现在可以专注于研究NPC功能的分子基础,例如mRNA如何从细胞核输出以及许多NPC相关疾病的根本原因,目的是开发新的疗法。”

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