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  • Transwell迁移/侵袭实验


    一、实验原理

    Matrigel是从小鼠EHS肉瘤中提取的基质成分,含有LN、IV型胶原、接触蛋白和肝素硫酸多糖,铺在无聚乙烯吡硌烷酮的聚碳酸酯滤膜上,能在DMEM培养基中重建形成膜结构,这种膜结构与天然基质膜结构极为相似。

    滤膜孔径一般为8um,而且膜孔都被Matrigel覆盖,细胞不能自由穿过,必须分泌水解酶,并通过变形运动才能穿过这种铺有Martrigel的滤膜,这与体内情况较为相似。

    铺有Martrigel的滤膜放在以Blind Well腔或MICS腔上下室之间,铺有Martrigel面朝向上室,在下室中加有趋化剂,如一定浓度的LN、FN或小鼠3T3条件培养液或人睾丸上皮成纤维细胞培养液,上室加入重悬的瘤细胞,具有侵袭能力的细胞在趋化剂诱导下开始穿膜运动。细胞穿膜所用的时间与Martrigel的用量有关,选择25ugMartrigell铺膜,16小时后观察结果较为合适。穿过滤膜的细胞多数粘附在滤膜下表面,可用棉签将上表面的细胞拭去,然后用乙醇固定滤膜,PE染色,在光镜下观察统计穿过Martrigel的细胞数。另外用Transwell小室也可进行重建基质膜侵袭分析,这一方法是在Transwell小室吊篮式上腔的滤膜上铺上30ugMartrigel,加入细胞72h后观察结果。值得注意的是,细胞在TransWll腔中培养72小时后,有相当数量穿过滤膜的细胞不再粘附在滤膜下表面,而是脱落进人下腔溶液中.因此统计穿过基质膜的细胞数目时应把这部分细胞考虑在内。肿瘤细胞穿过重建基质膜的能力与它的体内侵袭转移能力表现出较好的相关性,可以用重建基质膜模型初筛抗侵袭药物。 

    在上述分析中,如果不在膜上铺Martrigel而直接将8um孔径滤膜安放在侵袭腔室上下腔室之间,细胞通过变形运动穿过滤膜,用这种模型对分析细胞运动能力和药物对细胞运动能力的影响。另外,在下室中加有LN或FN或在滤膜下表面铺上LN或FN,可分析药物对肿瘤细胞的趋化性或趋固性的影响。

     


    二、应用简介

    肿瘤细胞通过膜表面特定受体与基质或基底膜的层粘连蛋白、纤维连接蛋白和IV型胶原等相粘连,然后肿瘤细胞可释放蛋白水解酶或激活基质中已存在的酶原,使基质成分降解,最后肿瘤细胞运动而充填到被水解了的基质的空隙处,如此三个过程不断重复肿瘤细胞不断向深层侵袭。

    肿瘤细胞侵袭实验(TumourInvasionAssay)可应用于:

    (1)研究各种细胞因子对恶性肿瘤细胞侵袭和转移的影响;

    (2)一些抑制血管生成的新药研究;

    (3)研究肿瘤细胞侵袭和转移机制。


    三、实验方法

    Step1:制备条件培养基

    Step2:包被基底膜

    Step3:水化基底膜

    Step4:接种细胞

    Step5:培养细胞

    Step6:固定及染色

    Step7:镜检


    四、样本送检要求



    五、案例展示

    图一

    图二


    六、常见问题

    1、24孔板下室一般加入600ul的培养基,特别注意的是,下层培养液和小室间常会有气泡产生,一旦产生气泡,下层培养液的趋化作用就减弱甚至消失了,在种板的时候要特别留心,一旦出现气泡, 要将小空提起,去除气泡,再将小室放进培养板;

    2、接种的细胞应选择处于对数生长期且状态良好,细胞计数需准确;

    3、待细胞迁出,且形态展开后即可固定染色;

    4、染色后,可用棉签轻轻擦掉上层未迁出细胞;

    5、拍照时,同一视野不可重复拍照,膜上小孔清晰,细胞形态明显,所有照片的背景需统一。


    七、服务流程

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