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  • Northern杂交

    一、 实验原理

    继分析DNA的Southern杂交方法出现后,1977年Alwine等人提出一种与此相类似的、用于分析细胞总RNA或含poly A尾的RNA样品中特定mRNA分子大小和丰度的分子杂交技术,这就是与Southern相对应而定名的Northern杂交技术。这一技术自出现以来,已得到广泛应用,成为分析mRNA最为常用的经典方法。
         与Southern杂交相似,Northern杂交也采用琼脂糖凝胶电泳,将分子量大小不同的RNA分离开来,随后将其原位转移至固相支持物(如尼龙膜、硝酸纤维膜等)上,再用放射性(或非放射性)标记的DNA或RNA探针,依据其同源性进行杂交,最后进行放射自显影(或化学显影),以目标RNA所在位置表示其分子量的大小,而其显影强度则可提示目标RNA在所测样品中的相对含量(即目标RNA的丰度)。但与Soughern杂交不同的是,总RNA不需要进行酶切,即是以各个RNA分子的形式存在,可直接应用于电泳;此外,由于碱性溶液可使RNA水解,因此不进行碱变性,而是采用甲醛等进行变性电泳。虽然Northern也可检测目标mRNA分子的大小,但更多的是用于检测目的基因在组织细胞中有无表达及表达的水平如何。


    二、应用简介

    1、定性及定量分析基因转录水平差异;

    2、检测目的基因是否具有可变剪切产物或者重复序列。


    三、 实验方法

     


    四、样本送检要求


    五、案例展示


    六、常见问题

    1.为了抑制RNA酶的活性,所有用于Northern印迹的溶液,均须用经DEPC处理过的无菌去离子水配制。DEPC是一种致癌剂,须小心操作。尤其在用DEPC处理乙酸铵时,因为DEPC能与铵离子反应产生氨基甲酸乙酯(一种潜在的致癌剂),故在以DEPC处理乙酸铵时,更须分外小心。

    2.RNA极易被环境中存在的RNA酶降解,因此须特别警惕RNA酶的污染。操作时必须仔细、小心,严格按同位素操作规程进行,以防止同位素污染。

    3. 必要时,可采用Sephades G-50柱层析法纯化标记的探针,以去除标记反应中未结合的(游离的)核苷酸。

    3. 膜的重复使用:结合了待测RNA的膜与探针杂交后,可经碱或热变性方法将探针洗脱,膜可反复使用与其它探针杂交。方法如下:杂交的膜(注意:杂交过的膜在保存过程中不能干燥,否则探针将会与膜形成不可逆的结合)置100℃ 0.5% SDS中煮沸3min,自然冷却至室温后,将膜放入双蒸水中漂洗2-3遍。取出膜,用滤纸吸去膜表面的水份。将膜直接进行另一种探针的杂交或用保鲜膜包好,室温下真空保存。



    七、服务流程

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